怎樣診斷生殖器皰疹
本文已影響2.21W人
本文已影響2.21W人
感染的診斷要依據病史、臨牀表現和實驗室檢查結果而定。有不潔性交史,而且在生殖器部位出現皮膚紅斑和原發性水皰,易復發等不難診斷。必要時可作皰液塗片,培養、接種、免疫熒光檢查。血清免疫抗體測定等,均有助於診斷和確定病毒類型。
一、細胞學方法
對皮損刮片做Wright-Gemsa (Tzanck試驗)或Papanicolaou染色,可檢出HSV感染特徵的鉅細胞包函體,但不能區別HSV感染或水痘 — 帶狀皰疹病毒感染,敏感性僅為病毒分離的60%。
二、培養法
從水皰底部取材做組織培養分離病毒,為目前較敏感、最特異的檢查方法,需5-10天,因其技術條件要求高,價格昂貴,不能普遍使用。
三、抗體檢測
目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測,如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測HSV-2抗體,具有敏感性,且能區分HSV-1和HSV-2的優點。
四、基因診斷
(一)用PCR分型檢測單純皰疹病毒
PCR是一種敏感性高,特異性強的快速檢測方法,標本中含有1fg HSV-DNA就可以檢出,其在HSV感染的診斷研究中發展較快,且分型檢測HSV是發展的趨勢。
1、標本採集和處理
(1)標本採集
①腦脊液:直接無菌採取患者0.5ml腦脊液標本於無菌試管送檢。如肉眼可見血色,應離心取上清。
②羊水及嬰兒血清: 同上,應避免溶血
③腦組織: 腦組織屍檢、活檢標本, 加1ml PBS標本緩衝液研磨後,待檢。
④眼及皮膚病灶分泌物:用預測(半乾)棉拭子直接取患處分泌物, 置1ml PBS標本緩衝液中送檢。
⑤生殖器(宮頸、陰道、外陰、陰莖)標本:先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢,再用預潮棉拭子用力擦拭患處分泌物,置1ml PBS標本緩衝液中送檢。
(2)標本處理
①預處理:所有液體標本均可直接進行模板製備;可以取100μl標本液,離心5000 r/ min×5min後,去上清,取沉澱物進行模板製備。
②模板製備:a: 蛋白酶K消化裂解法:沉澱物加100μl蛋白酶K消化裂解液,55℃1 h後,煮沸10 min,離心5000 r/ min×5min,收集上清。 b: 水煮法:沉澱物加100μl蒸餾水,搖均水煮20 min,離心5000 r/ min×5min收集上清。c: 1%Triton X-100裂解法:取採集的標本液100μl,加入1μl Triton X-100,水煮20 min,5000 r/ min×5min,收集上清。d: 5%NP-40裂解法:取採集的標本液100μl,加5μl NP-40,水煮20 min ,5000 r/ min×5min收集上清。e: 如標本溶血嚴重經上述裂解處理後,再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉澱DNA,加10μl DW溶解待檢。#p#副標題#e#
2、PCR擴增
(1)引物設計。以HSV DNA聚合酶的高保守區為檢測靶序列以確保特異性。設計3個引物,一個上游共同性引物,DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′):二個下游特異性引物,DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′ )和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′),可以分別擴增出HSV-1 469bp DNA片段(1981~2359)、HSV-2 391bp片段(1561~1953):從二型PCR擴增產物中設計了一個不分型的特異性探針HSVP3 5 ‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)。
(2)PCR實驗體系。取模板10μl: DNAP5 0.5(0.2μmol/L):DNAP3-1 0.5μl (0.2μmol/L):DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L):4×dNTP 8μl(4×200μmol/L):10×dNTP 8μl(4×200μmol/L);10×緩衝液10μl:DMSO 4μl;加DW 65.5μl; 石蠟油 30μl.。
水煮(96℃~100℃
加TaqDNA聚合酶1μ
72℃
↓
95℃
↓
65℃60s → 72℃
↓ 33個循環
70℃
3.擴增產物的檢測和分析
(1)瓊脂糖凝膠電泳染色法:取擴增產物20μl加樣品緩衝液4μl混勻後,點樣於2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳15~20min,溴化乙錠(EB)染色5min,於紫外燈下觀察結果在溴酚藍後面有一條或二條亮紅帶為陽性結果,HSV-2帶在前,HSV-1帶在後,無帶則為陰性結果。
(2)XhoI酶譜法:取HSV-1型PCR產物50μl加XhoI50U,37℃1h後,置3%瓊脂糖凝膠中,70V電泳15~20min,可產生46bp片段帶(引物後面);與正常PCR產物比較,XhoI酶切後的大片段電泳位置前移。
(3)Southern印跡法:PCR產物20μl經電泳分離後,用變性液處理60min,再用中和液處理90 min,轉移至硝酸纖維素膜上:80℃烤膜2 h,42℃預雜交(雜交液中)30 min, 加入32p標記HSVP3探針後,42℃雜交過夜;次日用1%SDS/ PBS pH7.2, 42℃洗15min, 0.5% SDS/PBS pH7.2, 42℃洗15min; 膜置X線暗盒內放射性自顯影12~15h, 顯影為陽性, 不顯影為陰性。
(二)套式
套式PCR(nested primers-polymerase chain reaction,NP-PCR)是通過“外側”、“內側”兩對引物,即一對擴增較大DNA片段的“外側”引物和一對位於擴增產物中再擴增小片段的“內側”引物,這樣兩次連續放大可以提高PCR檢測的靈敏度,保證產物的特異性。但該方法不能分型,能100%檢出HSV-1,50%檢出HSV-2,應改進分型檢測HSV,更好地在臨牀應用和基礎研究中推廣應用。
1、標本處理:
(1)標本採集同上
(2)DNA 製備:①腦脊液:取100μlCSF 水煮15min,加入250μl無水乙醇,放-30℃10 min;離心10000g30 min,去上清,30℃乾燥後,加入10μl DW; ②腦組織細胞:取沉澱物加100μl蛋白酶K消化裂解液,56℃作用1h,水煮10 min;取上清加入等體積酚一氯仿(V/V),輕搖10 min,離心10000r/ min×10 min;取水相,加入250μl DW溶解。#p#副標題#e#
2、PCR擴增
(1)引物設計:選擇HSV1糖蛋白D基因為檢測靶基因。
NP-PCR 的引物和探針序列
“外”引物
“內引物”
探針
(2) PCR實驗體系和程序: 反應體積為50μl;模板10μl;BJHSV1.1 0.5μl(0.2pmol/L); BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L); 10×緩衝液5μl; 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L);DW 27μl; 石蠟油30μl。循環參數為95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循環20次, 取其擴增產物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反應體系中進行套式擴增, 先95℃變性2min,循環參數為95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循環30次後,72℃延伸5 min;。
(3) 擴增產物分析:
① 瓊脂糖凝膠電泳染色法:
取擴增產物10μl點樣於2%瓊脂糖凝膠中, 70V電泳15-20min,溴化乙錠染色5min,於紫外燈下觀察結果,在溴酚蘭後面有一條,或二條亮紅條帶為陽性結果, HSV-2帶在前,HSV-1帶在後,無帶則為陰性結果。
② Southern印跡法:
PCR產物20μl 經電泳分離後,用變性液處理60min,再用中和液處理90min,轉移至硝酸纖維素膜上,80℃烤膜2h,42℃預雜交(雜交液中)30min,加入32P標記HSV探針後,42℃雜交過夜,次日用1%SDS/PBS pH7。2,42℃洗15min,0.5%SDS/PBS pH7.2,42℃洗15min;膜置X線暗盒內,放射性自顯影12-15h,顯影為陽性,不顯影為陰性。
(三)、聚合酶鏈反應—酶譜法
具有經濟廣泛等特點;不僅能一次性分型檢測HSV-1,HSV-2,EBV,CMV四種病毒,而且方法本身快速、方便、無放射線損傷,易被實驗室接受。可檢出3個CFU的HSV1,靈敏度高,能檢測出中樞神經系統感染第1dCSF中HSV DNA陽性結果,並可用於藥物治療效果的評價。由於病毒的變異性,會出現酶切點突變丟失現象,從而造成酶切陰性結果。對此可以通過型特異性探針或序列分析解決。
1. 標本處理
(1)標本採集,方法同上。
(2)DNA模板製備:每份標本取200μl,按200μg/ml加入蛋白酶k,56℃作用
加入等體積的酚—氯仿(v/v)輕搖10min,離心1000r/min×5min;取水相加入500μl(2.5倍體積)無水乙醇,-20℃過夜沉澱DNA,離心15000r/min×5min,吸去液體,30℃乾燥後,加蒸餾水25μl溶解, 待檢。#p#副標題#e#
2. 引物設計:
P1,5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′
P2,5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′
(1)PCR實驗體系:
反應體積100μl; 模板10μl ; P1 0.5μl(10pmol/L) ,P2 0.5μl(10pmol/L); 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L); 10×緩衝液10μl, DMSD 5μl, DW 65μl, 循環參數為94℃60s; 60℃60s; 72℃60s;循環40次72℃延伸4min。
(2)擴增產物檢測與酶切分型
①第一步電泳鑑定: 取10μlPCR產物加4μl樣品緩衝液,加入2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳(5-20min)加EB染色5min後,紫外燈下觀察,可初步鑑定擴增產物大小。
②酶切分析:分別取20μlPCR產物於2個Eppendorf管中,加入50μl無水乙醇,-20℃沉澱DNA,再分別用20μlSmal和BamHI反應緩衝液溶解,加入SmaI或BamHI 50U於相應Eppendorf 管內,37℃作用1h。
③第二步電泳分型,取10μlPCR酶切物加4μl樣品緩衝液,加到2%瓊脂糖凝膠中,70V電泳,15-20min後, EB染色5min,與同步加入未酶切的PCR產物相對照。 紫外燈下觀察, 結果如下
PCR-EC法檢測四種病毒結果
病毒型號靶片段
HSV2518bp—
CMV589bp不需酶切,第一步電泳就可以區分#p#副標題#e#
(四)用RT-PCR檢測單純皰疹病毒
RNA的聚合酶鏈反應(RNA-PCR),可能通過檢測HSV不同期的RNA,這不僅可診斷HSV感染,而且有利於HSV的潛伏期感染機制的深入研究。
RT-PCR是以RNA為模板經逆轉錄反應(RT)產生cDNA,再以cDNA為模板進行PCR擴增以達到檢測目的。因此,RNA-PCR也可稱為RT-PCR。
1、標本處理:
組織塊細胞總RNA提取,取100mg組織標本,加1ml硫氰酸胍變性液,於勻漿器中,室温研磨均勻後,移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc, 1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻, 用力振搖10s, 置冰浴15min。10000g4℃,離心20min,取上清水相(上層DNA、下層DNA和變性蛋白質)加入等體積異丙醇置-20℃1h, 沉澱RNA。離心 15000r/min×10min,棄上清, RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解, 再加0.3ml異丙醇沉澱, -20℃1h, 沉澱RNA. 離心15000r/min×10min, 去上清, 沉澱RNA用75%冷乙醇洗一次, 真空乾燥。。加10μl TE緩衝液(pH7.4)溶解,低温保存備用。臨用前冰浴溶解。
2、PCR擴增
(1)引物設計: 選擇HSV-1ICPO基因(極早期)為檢測靶基因。設計2個引物,
P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′
P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以擴增ICPO 中266bp序列。
1個探針:5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。
(2)PCR實驗體系: 總反應體積為50μl,模板10μl (0.25-1.0μg)P1 1μl (20pmol/L);P2 1μl (20pmol/L); 4×dNTP 4μl(200μmol/L); 10×緩衝液5μl; AMV(逆轉錄酶) 2μl (50U); DW 26μl; 循環參數, 94℃變性2min後 94℃50s,60℃60, 72℃60s,循環40次後72℃延伸5min。
3、擴增產物的鑑定:
(1)瓊脂糖凝膠電泳染色法:取10μl PCR擴增產物加4μl 樣品緩衝液,混勻後加樣2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳15-20min,EB染色5min。紫外燈下觀察擴增條帶。
(2)Southern印跡雜交法:用32P標記的特異性探針檢測PCR產物,方法同上。
總之,在HSV感染性疾病的臨牀診斷中,PCR能對前病毒或潛伏期低複製的HSV特異性靶DNA片段進行擴增檢測,遠較DNA探針敏感,並能在血清中抗體出現前就可以檢出。因此,PCR無論是作為基礎研究手段,還是作為臨牀檢驗診斷方法,均具有廣闊的前景。
五、病理組織學診斷
細胞內水腫,基底層形成大水皰,病灶周圍有多核鉅細胞浸潤,特別是多核白細胞與淋巴細胞充斥於病灶中間。#p#副標題#e#
1.原發性
(1)潛伏期:為2~7天,常為3~5天。
(2)好發部位:男性多發生於龜頭、冠狀溝、尿道口、陰莖體及陰囊。女性好發於外陰、陰道及宮頸。兩性均可見於肛周、大腿及臀部。
(3)皮損形態及演變:患處先有燒灼感,隨即出現多個羣集的紅色斑丘疹,並迅速變成小水皰。皰液起初清亮,以後漸變為膿性。水皰易破潰,形成糜爛或淺潰瘍,伴明顯疼痛。之後結痂而愈,病程約2~4周。
(4)全身症狀:發病前或發病時可有全身症狀,如發熱、頭痛、全身不適、頸項強直和骶2~4段感覺異常,或有排尿困難和白帶增多。幾乎所有患者均可伴腹股溝淋巴結腫大及壓痛。
2.複發性
約在原發性GH痊癒後1~4個月發生。首次HSV-2感染後1年內近60%的患者復發,第1年內可復發4~6次,以後復發次數減少。eves等發現在生殖器感染者中,HSV-1感染者複發率為14%,而HSV-2感染者則有60%復發。
複發性GH患者可有上述激發因素,或有前驅症狀,全身症狀較輕,復發部位多在原處,病程也較短,皮損約經10天左右即消退。由於病損反覆發作,難以控制,患者易出現精神負擔和性功能障礙,甚至發生抑鬱症等。但其損害與原發性者甚為相似。
3.特殊型
(1)男性同性戀者GH:本病僅次於淋球菌引起的肛門直腸炎。有人從62例有肛門直腸症狀但淋球菌檢查陰性的男性同性戀者中,29%檢出了HSV-2。臨牀表現多為嚴重的肛門、直腸疼痛,其他症狀為便祕、肛門內有分泌物、裏急後重和發熱等。部分病人肛周有水皰或潰瘍。
(2)孕婦和新生兒GH:孕婦患GH後,其後果嚴重。對妊娠GH患者HSV-2攜帶者來説,最重要的是傳染給新生兒。當產道內存在HSV-2時,可有40%~60%的新生兒遭受感染,感染嚴重者可致死亡。
在妊娠早期,患GH的孕婦可影響胎兒,導致流產或死胎。新生兒的先天性感染,出生時可出現帶狀分佈的皰疹、癲癇發作、出血傾向與肝脾腫大。如通過產道感染或胎膜早破而發生逆行感染時,輕者出生後數日至數週可無臨牀症狀,早期可僅有吃奶較差、興奮,以後可發生病毒血症或皰疹性腦炎,重者發生播散性HSV感染,可出現高熱、呼吸困難、出血及中樞神經系統病變,預後不良。
因此,妊娠足月患GH者,如時間允許,應每週從陰道及子宮頸取材,檢查有無病毒感染,若細胞學或病毒培養陽性而羊膜尚完整,或破裂後不足6h,建議剖宮產,以避免胎兒經陰道分娩而發生新生兒HSV感染。
HSV-2感染與宮頸癌:有證據表明,生殖器HSV-2感染可能與宮頸癌的發生有關。血清流行病學檢查發現,宮頸癌患者血清中抗HSV-2抗體較對照組婦女明顯增高。Nahmias等發現,GH患者發生宮頸非典型增生者為對照組的2倍,而發生原位癌者則為對照組的8倍。近年來研究證明,患侵襲性宮頸癌和癌前期病變的婦女宮頸脱落細胞中,HSV-2抗原陽性率明顯高於對照組,這種HSV-2抗原位於腫瘤細胞的胞質內,提示為腫瘤細胞表達的病毒抗原。有人發現,宮頸有高度非典型增生、原位癌及鱗狀細胞癌者的活檢組織中,用間接免疫熒光染色可發現其中的HSV-2抗原。應用DNA-RNA原位雜交技術在宮頸癌和癌前期組織中67%可發現HSV-2特異性mRNA。Frenkel等在宮頸癌組織中檢出HSV-2的DNA。還有作者從手術切除後經放射的宮頸癌病變組織中分離出了HSV-2。
HSV-2感染與HIV感染 與其他生殖器潰瘍性疾病一樣,GH增加了HIV感染的危險性。HSV感染是HIV感染的輔助因子。在HIV感染者尤其是HIV感染的同性戀者中,HSV-2感染率更高,且GH的併發症多而嚴重。在AIDS患者中,耐阿昔洛韋(無環鳥苷)的HSV毒株感染多見。
根據病史、症狀和皮膚或黏膜表現,一般不難作出診斷。必要時可進行實驗室檢查,以明確病原體。
男性生殖器皰疹怎麼治療
生殖器皰疹如何治療?
皰疹性咽峽炎應該怎麼護理
生活中怎麼預防生殖器皰疹
帶狀皰疹怎麼治療:帶狀皰疹好癢,帶狀皰疹會傳染嗎
如何護理生殖器皰疹
生殖器皰疹傳播途經多
怎麼正確認識生殖器皰疹
生殖器皰疹要怎麼才能預防
為什麼生殖器皰疹的誤診率偏高
生殖器皰疹怎麼治
生殖器皰疹的治療
什麼是生殖器皰疹
男性怎麼預防生殖器皰疹
生殖器皰疹又疼又癢怎麼治?
生殖器皰疹復發怎麼辦
生殖器皰疹能治好嗎
帶狀皰疹怎麼辦?帶狀皰疹偏方
生殖器皰疹的保健方法
生殖器皰疹引起男性不育?生殖器皰疹的危害
男性生殖器皰疹症狀
避孕套能預防生殖器皰疹嗎 預防生殖器皰疹的方法是什麼
全面瞭解生殖器皰疹
生殖器皰疹是怎麼傳播的
生殖器皰疹是性病嗎
生殖器起水泡 生殖器皰疹的三大症狀
怎麼治療生殖器皰疹效果好
生殖器皰疹發病的原因
孕期發現生殖器皰疹怎麼辦
妊娠期怎麼應對生殖器皰疹
生殖器皰疹如何治療
男性生殖器皰疹復發怎麼辦
判斷生殖器皰疹的方法有哪些