艾滋病實驗室檢測現狀

艾滋病是嚴重威脅我國人民健康的疾病之一，目前在我國流行趨勢依然嚴峻。衛生部、聯合國艾滋病規劃署和世界衛生組織聯合評估顯示，截至2009年底，累計報告艾滋病病毒感染者和艾滋病病人32.6萬例，其中艾滋病病人10.7萬例，死亡報告5.4萬例，估計中國存活艾滋病病毒感染者和病人約74萬人，其中艾滋病病人爲10.5萬人。HIV感染的實驗室檢測在HIV感染的診斷、疾病進展的監測、抗病毒療效觀察和耐藥監測中至關重要，是艾滋病防治工作的重要基礎。目前臨牀檢測內容包括HIV抗體、P24抗原、HIV病毒載量、HIV耐藥檢測、CD4+T淋巴細胞計數等。爲滿足目前艾滋病檢測工作的實際需要，2009年9月中國疾病預防控制中心頒佈了《全國艾滋病檢測技術規範（2009年版）》，對2004年版的內容進行了修改、增補和完善。HIV的檢測必須遵守國家制定的《艾滋病檢測工作管理辦法》和《全國艾滋病檢測技術規範（2009年版）》（以下簡稱《規範》），嚴格進行。

一、HIV抗體檢測

HIV抗體檢測不同於其他病原微生物的檢測，任何錯誤的診斷，包括假陽性或假陰性，都會對被檢者甚至他人造成重要的影響。因此，HIV抗體檢測必須嚴格按照《規範》要求，由接受過專門技術培訓並獲合格證書的技術人員在當地衛生行政部門審批合格的實驗室中進行，整個實驗過程應有嚴格的質量保證體系。

HIV抗體檢測分爲篩查試驗和確證試驗，可用於診斷（確定個體HIV感染狀況）、監測（瞭解不同人羣HIV感染率及其變化趨勢）及血液篩查（防止輸血傳播HIV）。篩查試驗根據檢測原理不同分爲酶聯免疫吸附法、凝集法和層析法，可對血液、唾液和尿液標本進行常規或快速檢測。臨牀用於血液篩查的方法包括酶聯免疫試驗（ELISA）、免疫熒光法、化學發光法等，常用的爲酶聯免疫法（ELISA）。自1985年第一代ELISA試劑問世以來，隨着醫學技術的發展，包被抗原已從一代的全病毒裂解物發展爲目前以基因重組和多肽抗原包被和標記、有着良好敏感性和特異性的三代雙抗原夾心試劑，檢測亞型包括HIV-1、HIV-2和HIV-1型的O亞型。第四代ELISA可同時檢測P24抗原和HIV-1/2抗體，進一步縮短了窗口期。此外，按《規範》要求，快速檢測由於簡便快速，適用於應急檢測、門診急診檢測，包括明膠顆粒凝集試驗、斑點ELISA、斑點免疫膠體金快速試驗、艾滋病唾液檢測卡等。對用ELISA試劑或快速診斷試劑進行的篩查實驗如呈陰性反應，即報告HIV抗體陰性；對呈陽性反應的標本，篩查實驗室應用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的試劑，或另外兩種不同原理或不同廠家的試劑進行復檢試驗。如兩種試劑複測均呈陰性反應，則報告HIV抗體陰性；如均呈陽性反應，或一陰一陽，需送艾滋病確認實驗室進行確認。篩查試劑必須是HIV-1/2混合型、經國家藥品監督管理局（SDA）註冊批准、批檢合格、在有效期內、推薦使用經臨牀質量評估敏感性和特異性均高的試劑。

HIV抗體篩查呈陽性反應的標本由於存在假陽性的可能，必須進行確證試驗。其方法包括免疫印跡試驗、條帶免疫試驗、放射免疫沉澱試驗及免疫熒光試驗，目前以免疫印跡試驗最爲常用。確認試劑必須是經SDA註冊批准、在有效期內的試劑。免疫印跡試劑有HIV-1/2混合型和單一型，按《規範》要求，先用HIV-1/2混合型試劑進行檢測，根據《規範》中判定免疫印跡試驗結果的基本原則並參照所用試劑說明書綜合判定，無HIV抗體特異帶出現的報告HIV抗體陰性；出現HIV抗體特異帶，符合HIV-1抗體陽性判定標準，則報告HIV-1抗體陽性。如出現HIV-2型的特異性條帶，需用HIV-2型免疫印跡試劑再做HIV-2型抗體確證試驗，呈陰性反應，報告HIV-2抗體陰性；呈陽性反應的則報告HIV-2抗體血清學陽性，如需鑑別應進行核酸序列分析。如果出現HIV抗體特異帶，但不足以判定爲陽性，則判爲HIV抗體不確定。對HIV抗體不確定者，新版《規範》修改了隨訪的時間，將3個月的隨訪週期縮短爲4周，要求在4周後隨訪檢測，如帶型沒有進展或呈陰性反應，則報告陰性；如隨訪期間出現符合判定標準的HIV-1抗體陽性反應，則報告陽性；如隨訪期間帶型有進展，但不滿足陽性標準，應繼續隨訪到8周。第8周時如帶型沒有進展或呈陰性反應則報告陰性；滿足HIV抗體陽性診斷標準則報告陽性，不滿足陽性判斷標準可視情況決定是否繼續隨訪。

爲確保HIV抗體篩查的準確性，在所有實驗中必須包含有內部對照質控血清和外部對照質控血清。內部對照質控血清指試劑盒內提供的陽性和陰性對照血清，是質量控制的基礎，每次檢測必須使用內部對照，而且只能在同批號的試劑盒中使用。外部對照質控血清是由實驗室設置的弱陽性對照，一般以該試劑盒臨界值（Cut off）的2-3倍爲宜，可購買或由實驗室自己製備。此外，全國各艾滋病篩查實驗室需參加本省艾滋病確認中心實驗室組織的室間質量評價，各艾滋病確認中心實驗室和艾滋病確證實驗室需參加國家艾滋病參比實驗室組織的室間評價，以確保HIV抗體檢測質量。

二、HIV-1 P24抗原檢測

HIV-1 P24抗原檢測可用於HIV-1抗體不確定或窗口期的輔助診斷；HIV-1抗體陽性母親所生嬰兒早期的輔助鑑別診斷；第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性，但HIV-1抗體確認陰性者的輔助診斷。P24抗原檢測一般用ELISA雙抗體夾心法試劑，試劑必須經過SDA批准註冊、在有效期內，其陽性結果必須依據試劑說明書經中和試驗確認。HIV-1P24抗原檢測的敏感性爲30-90%，該結果僅作爲HIV感染的輔助診斷依據，不能據此確診；HIV-1 P24抗原檢測陰性只表示在本試驗中無反應，不能排除HIV感染，臨牀中一般不作爲常規診斷項目。

三、HIV RNA定量測定（病毒載量檢測）及HIV核酸定性檢測

HIV核酸檢測可用於HIV感染的輔助診斷、病程監控、指導治療方案及療效判定、預測疾病進展等。常用的HIV病毒載量檢測方法包括逆轉錄PCR實驗（RT-PCR）、核酸序列擴增實驗（NASBA）、分支DNA雜交實驗（bDNA）以及實時熒光定量PCR技術。值得注意的是，每一種HIVRNA定量系統都有其最低檢測限，即可以測出的最低拷貝數或國際單位，RNA定量檢測時未測出不等於樣品中不含有病毒RNA，因此HIV核酸定性檢測陰性，只可報告本次實驗結果陰性，但不能排除HIV感染；HIV核酸檢測陽性，可作爲診斷HIV感染的輔助指標，不能單獨用於HIV感染的診斷。報告HIV核酸定量檢測結果時應按照儀器讀數報告結果，註明使用的實驗方法、樣品種類和樣品量，當測定結果小於最低檢測限時，應註明最低檢測限水平。

HIV核酸定性檢測也可用於HIV感染的輔助診斷，目前在分析HIV基因亞型和變異等基礎研究中應用。通常使用PCR或RT-PCR技術，使用分子生物學實驗室通用的擴增試劑，引物可來自文獻或自行設計，應儘量覆蓋所有或常見的毒株，也可使用複合引物。報告定性檢測結果時應註明反應條件和所使用的引物序列。此外，利用核酸檢測方法的高度敏感性，使用集合核酸擴增檢測技術和方法，對高度懷疑感染人羣且抗體陰性的樣品進行集合核酸檢測，可及時發現窗口期感染者。該方法較單份樣品的核酸檢測具有更高的成本效益。

四、CD4+ T淋巴細胞計數

CD4+T淋巴細胞是人體免疫系統最重要的細胞之一。HIV以CD4+T淋巴細胞爲靶細胞，感染後可導致CD4+T淋巴細胞進行性下降，使機體免疫功能受損，最終因機會性感染及腫瘤而死亡。CD4+T淋巴細胞絕對值的檢測在HIV感染的以下方面發揮了重要作用：瞭解機體的免疫狀態以確定疾病分期、監測疾病進程、評估疾病預後、制定抗病毒治療及機會性感染預防性治療方案及評估抗病毒治療療效等。目前用於CD4+T淋巴細胞檢測的方法分爲自動檢測方法和手工操作法。自動檢測方法包括流式細胞儀（單平臺一步法、多平臺三級程序法）和專門的細胞計數儀，手工操作方法則需要顯微鏡或酶聯免疫試驗設備。目前檢測CD4+T淋巴細胞數的標準方法爲流式細胞儀，可得出CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的絕對值及佔淋巴細胞的百分率。爲確保檢測的準確性，應制定質量保證計劃，建立內部質量控制制度，並參加室間質量評價。

五、抗病毒治療的耐藥監測

高效抗逆轉錄病毒治療爲目前針對HIV最有效的治療，但由於HIV可產生自發性高頻率的基因突變，在抗病毒藥物選擇性壓力下，HIV的突變可促使HIV耐藥株的產生，並進一步引起多種藥物交叉耐藥，成爲遏制AIDS流行的主要障礙之一。目前常用的耐藥檢測方法包括基因型和表型HIV 耐藥檢測。當病毒對某些藥物產生耐藥時，病毒基因會發生一些明確的突變，因此，可應用病毒耐藥基因型的檢測預測某些藥物的治療效果。其方法爲從患者血液標本中分離HIV核酸物質，進行核酸序列分析，確定與耐藥性相關的病毒變異位點。在確認變異後，與既往耐藥或交叉耐藥研究比較，間接地估計藥物耐藥情況，簡單快速，費用低，結果分析較複雜，需由專業人員進行。基因型耐藥檢測方法有時並不能解釋某些耐藥突變之間的相關性，如各突變之間是否有協同或者抵抗作用。目前我國進行的耐藥性檢測主要爲基因型耐藥檢測。衛生部指導建立的全國HIV耐藥性監測網絡可及時掌握耐藥毒株出現的情況以及影響因素，爲國家HIV抗病毒治療提供了技術保障。表型HIV耐藥性檢測包括傳統的共培養方法和重組病毒表型檢測方法，能直接測出感染毒株對藥物的敏感度，並能揭示事先存在或交叉的耐藥情況，有利於指導 HIV-1 感染者有效地用藥。不足之處爲試驗慢且費用昂貴，技術要求高，多種影響因素導致重複性差，多需在P3級生物安全實驗室中進行，因此，其在臨牀上的應用受到限制。

六、HIV病毒分離

HIV病毒培養及分離可用於HIV-1感染的輔助診斷。HIV病毒分離需要在P3級生物安全實驗室進行，實驗條件及技術要求較高，目前多用於HIV相關的科學研究。

綜上，隨着我國艾滋病防控力度的不斷加大，對於監測和檢測技術的要求也不斷提高，艾滋病檢測工作量日趨增加。在現有基礎上進一步完善實驗室檢測的技術及質量控制，滿足國家艾滋病防治對於監測檢測工作的要求，是從事艾滋病檢測工作人員義不容辭的責任。